生信免疫分析竟然有这么多神器~零代码带你搞定免疫浸润！

点击上方基因名后单元格后会弹出一个散点图，显示浸润估计值与基因表达之间的关系。如下图所示：

2、Mutation——免疫浸润与突变状态间的相关性

输入基因后显示每种肿瘤类型的基因突变频率条形图。

3、sCNA——免疫浸润与体细胞CNV间的关联

该模块可以通过跨肿瘤类型的基因的sCNA状态比较免疫浸润分布，以堆积条形的形式展示目的基因在泛癌种中的不同sCNA状态的相对比例。

4、Outcome: 免疫浸润与临床结果的关联

该模块通过校正多变量Cox比例风险模型中的多个协变量，在热图中显示每个模型的标准化浸润系数。

点击热图的单元格都对应一个独立的Cox模型，点击后显示相应免疫浸润和癌症类型的K-M生存曲线，还可以通过左侧栏调整根据浸润水平高低进行分组，图中显示Cox回归模型的风险比HR和p值，如下图所示。

TIMER数据库功能强大，出图精美，小伙伴们可以多多尝试和发现更多的惊喜~

The Cancer Immunome Atlas

https://tcia.at/home

大家听到这个网站的缩写后是不是有种感觉，除了TCGA还有TCIA吗？这两者是不是有什么关系呢？答案是肯定的。TCIA是基于TCGA的二代测序数据开发的，并包含了其他几个大型肿瘤研究项目。

用Immunophenoscore工具开发了一种软件算法，从细胞群中区分不同的免疫细胞，并将TCGA的20种癌症样本的所有数据全部处理了，我们只需要查询即可。下图展示了该网站的检索界面，鼠标悬停在每个柱子上可以显示该数据集的Cases数量，点击进去就可以分析对应的癌种，左侧边的参数栏则提供一些个性化选择。

分析结果包含了“Patients list”、“Gene Expression”、“Cell type Fractions”、“GSEA”、“Heterogeneity”、“Neoantigens”、“HLA Typing”、“Supplementary”。

该数据库不仅可以查看TCGA中不同肿瘤的分析结果，其分析内容也值得我们借鉴，对于肿瘤样本的NGS数据， 可以进行基因表达与生存分析的关联分析，可以进行免疫细胞浸润分析，新抗原预测等分析内容。

首先我们来看参数栏，如下图所示可以根据自己的研究内容进行筛选，非常适合临床研究。

1、Patients list

我们以TCGA-BRCA数据库为例及逆行分析解读，点击“BRCA”对应的柱子即可进入以下界面。右侧栏中列出了每个肿瘤患者的ID, 性别，年龄等信息，并可以对分析结果根据IPS评分进行排序，点击患者ID, 可以查看详细的临床信息。

这里涉及到一个IPS，我们简单做一下介绍：IPS是根据代表性细胞类型基因表达z得分在0-10范围内计算的，其中更高的分数与更高的免疫原性相关。这是因为IPS对刺激因子（例如CD8 + T细胞基因表达）加权为正，而对抑制因子（例如MDSC基因表达）加权为负。最后，相对于加权平均z分数之和，基于0-10的比例来计算IPS。z分数等于或大于3表示IPS为10，而z分数等于或小于0则表示IPS为0，更高的IPS是更具免疫原性肿瘤的代表。

2、Gene Expression

在左侧的选择栏里筛选病人和免疫相关基因后，可对单个基因进行差异分析和生存分析，因其数据统计分析并不完善，生信分析前用于查询基因的临床意义还是比较方便的。

接下来我们试着分析以下，左下方的基因名称输入栏中包含了非常详细的免疫细胞分类及其亚型，可以单独或同时选择多个细胞类型进行分析。这里以输入“all immune genes”为例，点击上方基因可以获得表达量的箱式图、热图以及生存分析，还可以选择不同计算方式的表达值，得到的图片都可以下载。

3、Cell Fractions

该模块使用qyanTIseq和Cibersort两款软件分析肿瘤患者的免疫细胞组分，是CIBERSORT的不同计算方法结果，Absolute和Relative分别表示免疫细胞的绝对数和相对数。下图所示的是

4、GSEA

该模块用来分析在特定癌种中免疫细胞是否富集，以及单个免疫细胞对生存预后的影响。我们可以在下图的左下方红框中输入需要研究的免疫细胞类型进行GSEA富集分析。点击“Survival analysis”可以选择单个免疫细胞进行预后生存分析。下图中展示了两种分析结果，小伙伴们也可以进行自定义分析。

5、Heterogeneity

该模块用来分析不同肿瘤患者的异质性，对每个样本的抗原和遗传特征进行肿瘤异质性和克隆性的分析，以显示肿瘤的免疫特征和遗传特征。

6、Neoantigens

该模块用于分析肿瘤新抗原，提供了疾病的突变数和突变压力，同时展示预测到的新抗原结果，即下图所展示的Table。不过也仅仅是预测结果，想要通过实验验证还是和困难的。

我们再来看看该网站用于数据分析使用的工具“Immunophenoscore”，可将肿瘤样品的免疫表型可视化。

Immunophenoscore 评分主要由四部分组成：MHC molecular(MHC); Effector cells(EC); Immune Checkpoints(CP); Immunsuppressive Cells(SC)。如下图所示，车轮的外部包括各个因子，而内轮则说明特定类别中所包含的因子的加权平均z得分。

基于代表性的基因或免疫显象的基因集的表达，以0-10的比例计算免疫表型分数（IPS）。

根据刺激因子（细胞类型）对样本Z分数进行正加权，根据抑制因子（细胞类型）对样本Z分数进行负加权，然后取平均值。Z分数≥3被指定为IPS=10，Z分数≤0被指定为IPS=0。

这个模块通过考虑MHC分子（MHC），免疫调节剂（CP），效应细胞（EC），免疫抑制细胞（SC）这四种主要类型的基因（如活化的CD4+T细胞，活化的CD8+T细胞，效应记忆CD4+T细胞，Treg，MDSCs）来确定每个样本的IPS。

我们点击上图中蓝色的“Immunophenoscore”可进入如下界面，只要提供一个标准的表达矩阵即可，这里需要注意的是该工具要求表达数据使用TPM方法定量。

ImmuneCellAI

http://bioinfo.life.hust.edu.cn/ImmuCellAI#!/

ImmuCellAI作为一个免疫细胞丰度综合分析网络平台，估算了基于包括RNA-Seq和微阵列数据在内的基因表达数据集中24个免疫细胞浸润丰度，同时可以预测患者对免疫检查点抑制剂治疗的反应。

其中24个免疫细胞由18个T细胞亚型和6个其他免疫细胞组成：B细胞，NK细胞，单核细胞，巨噬细胞，中性粒细胞和DC细胞。该网站分析功能较为突出，且图片比较精美，对新手来说真的是一个不错的选择。下面我们就来进行实操演示：

1、Analysis——基因表达谱数据分析

“File upload” 模块上传分析数据，根据自己的数据类型选择合适的“RNAseq”或者“Microarray”。这里需要大家注意的是数据文件需要是用制表符分隔的，文件大小也不能超过50M。

“Analysis selection”用于选择分析类型，建议默认“immune cell abundance in sample”，结果会输出每个样本的免疫细胞丰度。

“immune cell abundancein groups”则会输出每组样本的免疫细胞丰度。而“ICB response prediction”则会输出疾病组免疫检查点治疗反应的预测结果。

“Run”模块会显示选择的分析类型和分析进度条。直到显示“Done”后表示已经分析完成，可以下载“Table”或者“Figure”结果。

接下来点击“ICB response”，最后点击Download下载预测分析结果。

2、Resource——TCGA数据库分析（浸润差异比较、生存分析及数据下载）

对于免疫浸润分析，同样符合酸菜校长提出的“挑圈联靠”定律，这里我姑且称之为定律了哈哈，因为实在是太精髓了~。

免疫分析第一步同样是差异分析，即免疫细胞浸润的差异比较，如下图所示，“Diff.Infiltration”用于分析TCGA泛肿瘤中不同免疫细胞类型在肿瘤和邻近正常组织之间的差异表达，使用Wilcoxon检验评估差异表达的统计学意义。

首先选择免疫细胞类型，点击“Submit”后就可以进行比较分析，结果以箱式图的形式展示了每种免疫细胞在泛癌种中肿瘤组织和癌旁组织中免疫细胞浸润丰度差异。

“Survival”模块中可以通过选择癌种及免疫细胞类型进行单个免疫细胞在肿瘤中的生存预后分析，图中注明了用于比较两组生存曲线的对数秩检验的P值。

并在结果界面中描述了数据集的详细信息，以及自动输出的Cox回归分析结果，包括危险比和统计显着性。

同时列出了在多变量Cox比例风险模型中的多个协变量包括临床因素（年龄，性别，肿瘤分期）和免疫细胞浸润水平。

此外，该网站同时支持TCGA数据下载，在“Download”模块中可以通过选择癌种及病理类型直接下载数据。

EPIC

https://gfellerlab.shinyapps.io/EPIC_1-1/

EPIC是一款利用肿瘤样本RNA_seq表达谱数据评估样本免疫细胞构成的软件，可以计算8种免疫细胞类型比例，我们的风老师已经对这个神器做过很详细的说明啦，在“挑圈联靠”公众号中搜索风老师推送的“单细胞类型分析杀器——EPIC”开始学习哦！

xCell

https://xcell.ucsf.edu/

xCell由dviraran团队于2017年开发的免疫浸润分析R包。通过反褶积整合了基因富集分析的优势，可以评估64种细胞类型，涉及多个适应性和先天免疫细胞、造血祖细胞、上皮细胞和细胞外基质细胞，其中包括48种肿瘤微环境相关细胞。因为我们这次分享的目的是0代码分析免疫浸润细胞，所以当然有更容易入手的方式，作者同时提供了xCell的分析和可视化网页版工具。

1、xCell网页版(http://xcell.ucsf.edu/)

我们只需以制表符分隔的文本格式或csv（最大1Gb）上传人类基因表达谱数据文件。表达矩阵的行名是基因名，列名是样本名，示例数据如下图所示。

xCell排序方式是使用表达水平而不是实际值，因此归一化没有影响，但是需要归一化为基因长度（RPKM /FPKM/TPM/RSEM）。接下来，我们标记数据是否为RNA-seq基因表达谱，然后选择xCell签名集（或其他签名集）。分析可能需要一段时间才能完成，因此请提供一个电子邮件地址。分析完成后，将发送以制表符分隔的文件格式下载结果的链接。

2、可视化分析结果的网页工具

（http://comphealth.ucsf.edu/xCellView/）

在该可视化工具中同样需要上传自己的数据，我们这里以一个简单的示例及逆行分析，文件格式同网页版示例。上传数据后，右侧栏会自动读入文件。

继续点击“”则会自动分析出可视化的热图，同样简单快捷，还可以直接下载用于文章发表，如下图所示。

好啦，今天分享的几款零代码生信免疫浸润分析的必杀神器是不是很惊喜呢~小伙伴们快快动手实战一下，说不定下一个5分+纯生信套路文章就是你的了！

参考文献

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